论著｜基于肿瘤类器官指导局部进展期甲状腺状癌临床个性化治疗可行性研究

　　【引用本文】郭子良，张歆玥，刘嘉烨，等. 基于肿瘤类器官指导局部进展期甲状腺状癌临床个性化治疗可行性研究[J]. 中国实用外科杂志,2023,43(8):894-899.

　　目的通过建立甲状腺状癌（PTC）病人来源的肿瘤类器官生物样本库，于体外模拟PTC的生物学行为，探讨肿瘤类器官作为临床前模型指导局部进展期PTC病人靶向治疗的可行性。方法收集2021年2月至2022年8月在四川大学华西医院甲状腺外科就诊的27例局部进展期PTC病人的肿瘤组织，分离培养PTC类器官，并对PTC类器官进行组织形态学评估，进一步用不同的靶向药物处理PTC类器官，用CellTiter-Glo检测类器官对靶向药物的敏感性，并与临床疗效匹配。结果27例病人中，共成功建立22例（81.5%）PTC类器官，均为通过穿刺从PTC病人肿瘤组织中建立。经过连续传代的PTC类器官仍保持与原始肿瘤组织的形态学一致。病人来源的PTC类器官与对应病人临床疗效的总体一致率为86.4%（19/22）。PTC类器官药敏试验显示敏感的病人部分缓解（PR）率及疾病稳定（SD）率分别为41.7%、58.3%。PTC类器官药敏试验显示耐药的病人PR、SD及疾病进展（PD）率分别为12.5%、37.5%、50.0%。PTC类器官药敏试验显示敏感及耐药病人的中位无进展生存期（PFS）分别为10个月（95%CI 8.2-11.8）、4个月（95%CI 2.6-5.4），差异有统计学意义（P＜0.001）。结论通过将临床实际疗效与PTC类器官药敏试验结果进行比对分析，证实将PTC类器官作为临床前试验模型制定靶向治疗方案、预判临床疗效具有可行性。

　　甲状腺状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是一类具有高度异质性的肿瘤, 其中局部进展期PTC对放射性131I治疗反应较差且易出现复发转移，总体预后不佳。不同局部进展期PTC病人对治疗的敏感性差异较大，因此肿瘤的个体化治疗十分必要［1-2］。类器官组织是一种三维细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性，具有与相应器官相似的空间组织，并能再现相应器官的某些功能，从而提供了一个高度生理相关的系统［3］。有研究根据结果得出，病人来源的类器官对不同抗肿瘤药物表现出不同敏感性，具有预测病人靶向治疗效果的潜能［4］。故本研究通过建立PTC病人的肿瘤类器官，旨在验证PTC类器官经过传代后与对应肿瘤原发灶组织形态学的一致性，并探究其作为临床前试验模型预测 PTC病人靶向治疗效果的可行性。

　　1.1 样本来源 PTC标本取自 2021-02-01—2022-08-31在四川大学华西医院甲状腺外科就诊的PTC病人。经超声引导穿刺样本共27例。本研究方案已获得四川大学华西医院伦理委员会的批准（No.20221642），所有参与研究的病人均已签署四川大学华西医院伦理委员会提供的知情同意书。

　　1.2 PTC类器官的培养 用杜比可磷酸缓冲盐（Dolbico phosphate buffer salt，D-PBS，Stemcell Technologies，37350）清洗组织3遍，以无菌刀具将 PTC穿刺样本剪碎至大小约2 mm×2 mm 的组织碎块，加入细胞消化液，在37℃孵箱中消化半小时。用加入1% 胎牛血清的DMEM［GIBCO，10099-141］培养基终止反应，以70mm 滤器研磨过滤，并接种到基质胶上，待胶凝固后，加入类器官增殖培养基。置于37℃细胞孵箱培养，显微镜下观察肿瘤类器官的形成和生长状态，每3 d换液1次，7～10 d传代1次。

　　1.3 免疫组化及荧光染色 用0℃含1%胎牛血清的DMEM收集肿瘤类器官，500 g 离心 3 min，弃上清，再加入 80% 浓度乙醇，混匀后 500 g离心3 min，弃上清，加入4%多聚甲醛（Sigma Aldrich，P6148）固定3h；依次用70%、85%、95% 及 100% 乙醇进行脱水处理，每步骤1～2 h；用与乙醇等体积的二甲苯混合处理1 h，纯二甲苯处理1～2 h；以全自动石蜡切片机将石蜡块制成6μm厚的切片，对组织切片进行HE染色，采用Zeiss（ZEISS，Imager. M2）显微镜观察并拍照［5］。对免疫荧光染色，用0℃含1%胎牛血清的DMEM收集肿瘤类器官，500 g 离心 3 min，弃上清，加入4%浓度的多聚甲醛固定15 min，铺片烘干。根据抗体推荐浓度，分别染色，并完成采图。

　　1.4 肿瘤类器官药敏试验将消化好的肿瘤细胞以2×103个细胞/2μL基质胶（孔）接种于96孔板，培养7 d后，更换为含有靶向药物的培养基，具体如下。安罗替尼浓度分别为 0、0.1、1及 10 mmol；索拉非尼浓度分别为 0、0.1、1及10 mmol；伦伐替尼浓度分别为 0、0.1、1及 10 mmol；依维莫司浓度分别为 0、0.1、1及 10 mmol；多那非尼浓度分别为 0、0.1、1及 10 mmol；继续培养72 h后，以 CellTiter-GIo 3D 细胞活力检测试剂盒检测细胞活性［5］。

　　移除含肿瘤药物的培养基后，用预热的D-PBS洗涤，加入与培养基等体积的 CellTiter-GIo 3D 检测试剂，震荡混匀5 min，室温下孵育30 min；采用多功能荧光酶标仪检测荧光强度，统计分析不同靶向药物的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）和肿瘤类器官抑制率（inhibitory rate，IR）。IR=（对照孔A值–试验孔A值）/对照孔A值×100%［5］。

　　1.5 临床用药方案及观测指标 临床病人用药方案基于医生经验制定。具体用药方案如下：索拉非尼，400 mg，1日2次，连续用药；伦伐替尼，8 mg（体重60 kg）或12 mg（体重≥60 kg），1日1次，连续用药；安罗替尼，10 mg（体重

　　60 kg）或12 mg（体重≥60 kg），1日1次，用药2周停药1周；多那非尼，300 mg，1日2次，连续用药；依维莫司，10 mg，1日1次，连续用药；观测指标为血常规、肝肾功能、颈胸部增强CT、MRI等。靶向治疗2周、1个月、2个月后每月于门诊随访评估病人靶向治疗疗效，治疗疗程主要基于病人影像学评估结果。

　　1.6 临床疗效分析 根据实体肿瘤疗效评估标准1.1（RECIST1.1）对肿瘤的治疗情况做疗效评估。完全缓解（complete response, CR）：目标病灶完全消失，所有目标结节须缩小至正常大小（短轴＜10 mm）；部分缓解（partial response, PR）：所有可测量目标病灶的直径总和低于基线%；疾病进展（progressive disease, PD）：整个研究过程中所有测量的靶病灶直径之和的最小值为参照，直径和相对增加至少20%；疾病稳定（stable disease, SD）：靶病灶减小的程度未达到PR，增加的程度也未达到PD水平，介于两者之间［6］。临床疗效评估中，临床治疗敏感定义为目标病灶出现CR、PR或处于稳定期但缩小比例介于20%~30%之间；耐药定义为PD或SD，但靶病灶增大或缩小比例＜20%，本研究中耐药的病人均为单靶向药物耐药。客观缓解率（objective response rate，ORR）=（CR+PR）/（CR+PR+SD+PD）×100%；疾病控制率（disease control rate，DCR）=（CR+PR+SD）/（CR+PR+SD+PD）×100%；无疾病进展生存期（progression-free survival，PFS）定义为病人自治疗开始至肿瘤进展或失访或死亡的时间［6］。

　　1.7 数据分析 使用SPSS软件（版本25.0）进行数据管理和统计分析。计量资料以中位数和上下四分位数（P25，P75）表示；计数资料以例（%）表示，率的比较采用 Fisher 确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2.1 穿刺样本类器官构建 本研究前期累计收集到穿刺样本27例，成功建立 22 例肿瘤类器官，总体成功率为 81.5%，其中2例肿瘤类器官在培养基中无法增殖分化，1例肿瘤类器官由于污染构建失败，2例类器官在传代4周后丧失干性，无法继续增殖。传代稳定的PTC肿瘤类器官在培养基中生存周期＞6个月，可连续传20代以上。肿瘤类器官冻存复苏及传代均不影响其生长和形态。

　　2.2 PTC类器官的形态学及组织病理学特征 本研究结果为，PTC病人来源类器官主要呈现两种不同形态，一种为花瓣样，内外可见明显的管腔和状结构，另一种为大小不一的球样空泡状结构。所有PTC病人的肿瘤类器官与其原发灶肿瘤组织的形态学及组织病理学特征高度一致。所有肿瘤类器官至少可传代5代以上并未见明显形态学改变（图 1a）。HE 染色提示肿瘤类器官可见明显的细胞异型性，与原发肿瘤表现出相同的聚集形态，具有状癌特异性形态，包括结构等（图 1a）。其次，肿瘤类器官具有PTC相关标记物的表达，并与原位组织标记物的表达一致（图1b）。

　　2.3 类器官导向临床耐药病人的临床治疗 将类器官药敏试验结果与病人临床疗效进行匹配，以评估PTC类器官对不同靶向药物疗效的预判价值。图2为通过PTC类器官药敏试验预判病人对索拉非尼的敏感性及临床疗效的结果示例，结果为类器官药敏试验敏感病人的临床疗效明显（图2a）；类器官药敏试验显示耐药的病人，临床疗效不佳（图2b）。

　　在22例器官药敏试验结果中，12例显示敏感，10例显示耐药，其中2例耐药病人后续改用类器官药敏试验敏感药物作为临床治疗方案；将类器官药敏数据和临床随访结果进行匹配，发现12例类器官药敏试验显示敏感病人的临床治疗效果与类器官药敏结论一致；7例类器官药敏试验显示耐药的病人，临床治疗效果表现为耐药。类器官与临床治疗效果的总体一致性为86.4%（19/22，表1）。图3为1例因靶向治疗耐药，后续采用类器官药敏试验结果指导临床治疗方案的案例结果示例。

　　2.4 类器官药敏与临床预后的关系 所有病人均获随访，随访时间6～15个月，中位随访时间为9. 3个月，PFS为3～15个月，中位数为8个月。PTC类器官药敏试验结果分别为敏感、耐药的病人的中位PFS分别为10个月（95%CI 8.2~11.8）、4个月（95%CI 2.6~5.4），两者PFS差异有统计学意义（P＜0.001）（图4）。分析PTC类器官药物敏感性与PTC病人临床特征之间的关系结果为，22例PTC类器官的药物敏感性与病人临床特征之间的关系差异无统计学意义（P0.05），见表2。类器官药敏试验显示敏感的14例病人PR及SD率分别为41.7%、58.3%；类器官药敏试验显示耐药的8例病人PR、SD及PD率分别为12.5%、37.5%、50.0%。类器官药敏试验结果为敏感的病人ORR（41.7% vs. 12.5%）及DCR（100% vs. 50%）明显优于结果显示耐药的病人。

　　病人肿瘤来源的类器官培养体系作为体外癌症模型已经成功地在包括甲状腺癌的多种类型癌症中建立［7-9］，并为进一步建立一个更能反映病人疾病的大型生物库提供了机会，该生物库能够最终靠使用药物敏感性检测为病人选择特异性敏感药物。然而，类器官技术能否预测甲状腺癌的临床疗效，特别是针对局部进展期PTC的病人，尚未可知［10］。本研究构建成功的22例PTC类器官均为通过穿刺从PTC病人肿瘤组织中建立，结果证明PTC类器官能够最终靠穿刺取得的微量样本建立并扩增，且其在某些特定的程度上保持了原有的组织病理学特征。而且，本研究通过开展类器官药敏试验，评估局部进展期PTC对靶向药物的敏感性，观察得到不同病人来源的PTC类器官中药物反应的显著异质性，与临床治疗反应的多样性是一致的。

　　本研究的最大的目的是探讨PTC类器官模型是否有可能作为一种诊断工具，以个性化的方式预测PTC病人，特别是局部进展期病人的治疗反应。首先比较PTC病人临床治疗疗效反应与类器官药物筛选的结果为，病人来源的PTC类器官与对应病人临床疗效的总体一致率为86.4%（19/22），表明大多数通过穿刺从肿瘤组织建立的类器官模型很好地概括了其对药物医治的临床相关反应。但有必要注意一下的是，有3例类器官药敏试验结果考虑耐药的病人，临床靶向治疗效果显示敏感。其原因可能为肿瘤内部高度异质性或穿刺到正常甲状腺组织，这提示在类器官药敏试验过程中，穿刺操作者的技能培训可能是药敏预测准确性的重要影响因素之一。同时，本研究之后发现类器官药敏试验敏感病人和耐药病人的中位PFS分别为10个月（95%CI 8.2-11.8）、4个月（95%CI 2.6-5.4），差异有统计学意义（P＜0.001），表明类器官药敏试验结果能反映病人预后。

　　为进一步深入研究，笔者团队利用类器官平台重新指导了耐药的局部进展期PTC病例治疗。有必要注意一下的是，耐药病人在重新选用类器官药敏模型筛选的新药后，成功实现肿瘤降级并完成了手术治疗，在个性化治疗后存活已＞2年。

　　本研究成功分离培养并建立了局部进展期PTC病人的肿瘤类器官生物标本库，证实PTC类器官与原发灶肿瘤组织在形态学及组织病理学层面保持高度一致，且经过连续传代后依然保持稳定。通过比对分析肿瘤类器官药物敏感试验结果与临床实际疗效，证实将PTC类器官作为临床前试验模型制定靶向治疗方案、预测临床疗效具有可行性，有望为推进局部进展期PTC的精准治疗，改善局部进展期PTC病人的预后提供理论支持和实践参考。

　　然而，本研究也存在一定的局限性。一方面，样本量相对较少，仅收集27例，成功建立22例。证据可靠程度相对不足。未来有待继续收集病例，扩大样本量，提高证据可靠度。另一方面，限于类器官药敏技术相对较新，开展时间不长，样本量有限，故选择用观测时间相对较短的ORR及PFS来比较病人预后。以ORR及PFS等作为观察疗效的指标，有几率存在一定的测量偏倚，且无法说明生存时间，无法验证类器官药敏模型是否能真正预测病人的生存情况。后续有待进一步延长随访时间，扩大样本量，以总体生存为结局指标进行研究，以更确切的说明病人预后情况。

　　［2］ 张浩，孙威，田文. 分化型甲状腺癌基础研究热点及未来方向［J］. 中国实用外科杂志,2021, 41(1): 76-79.

　　［5］ 陈豪，潘晓飞，张好刚，等. 结直肠癌患者肿瘤类器官生物样本库在预测化疗效果中的应用研究［J］. 中国普外基础与临床杂志. 2023, 30(2): 167-174.

　　［8］ 周文涛，楼文晖. 胰腺神经内分泌肿瘤临床前研究进展［J］. 中国实用外科杂志. 2021, 41(6): 657-661.

　　［10］ 刘延晴，林岩松. 碘难治性分化型甲状腺癌诊治策略及预后［J］. 中国实用外科杂志, 2019, 39(3): 216-220.